Морфология, физиология и генетика паразита и его взаимоотношения с растением-хозяином

Изучение физиологических особенностей паразита и внутривидового морфологического разнообразия дает ключ к правильному его определению, что интересно как для теории, так и для практики.

Морфологическая и физиологическая изменчивость наблюдается как в природе, так и в условиях чистой культуры. Проявляется она чаще и нагляднее всего в разнообразии размеров и форм спор, но может проявиться и рядом других признаков.

Изучение гриба методом чистых культур. Исследование гриба в условиях чистой культуры приходится проводить для детального изучения какой-либо одной или нескольких особенностей организма, так как в стандартных условиях культивирования любой признак проявляется особенно четко. В естественных условиях из-за различий в условиях произрастания или взаимодействия с другими организмами признаки могут затушевываться.

Чистая культура гриба — возбудителя парши яблони — была впервые получена Адерхольдом (R. Aderhold, 1896) на желатинизированных вытяжках из листьев и побегов яблони, груши, вишни, березы и свежих тыквенных растений.

Культуральные особенности гриба, выращенного из конидий или из сумкоспор, как указывает ряд авторов, бывают обычно почти одинаковыми.

Автором изучалось поведение штаммов гриба различного географического происхождения: северо-западный штамм-популяция (Ленинград), волжский (Саратов), украинский (Полтава), азербайджанский (Баку), московский (Москва), дальневосточный штамм-популяция (Хабаровск) и его моноспоровые изоляты, сахалинский штамм-популяция (о. Сахалин) и его моноспоровые изоляты.

На основании наблюдений за развитием гриба перечисленных штаммов на различных питательных средах (естественные: кусочки моркови и яблок в стерилизованном виде; искусственные: чистый агар, картофельный агар, картофельно-глюкозный агар, овсяный агар, яблочный агар, среда Чапека + агар, среда Чапека + агар с добавлением дрожжевого автолизата) мы пришли к заключению, что в качестве стандартной среды, дающей возможность подметить особенности развития гриба в чистой культуре, должна быть принята среда Чапека + агар, так как гриб на этой среде растет хорошо, но в то же время не настолько быстро, чтобы его особенности ускользали от внимания.

При изучении культуральных свойств вышеуказанных штаммов на среде Чапека выявлено 4 основных типа мицелия:

1-й тип — «мышь» — мицелий гриба тонкий, плотный, серый, вид колонии ровный, пушистый, напоминающий мех мыши

2-й тип — мицелий гриба, его гифы более толстые, жесткие, игловидные, светло-серые

3-й тип — колонии гриба пористые, ноздреватые, светло-серого цвета

4-й тип — колонии не плотные и не ровные, не пушистые, а как бы лизирующие, светлые

Наличие столь различных внешних признаков культуры гриба на единой среде говорит о большой неоднородности каждой популяции.

С целью выявления и сохранения однородных морфологических признаков гриба из одного типа мицелия каждой популяции были сделаны моноспоровые выделения штаммов. Таким образом выщеплялся клон из популяции, внешние культуральные признаки которого закреплялись путем отбора. При посеве таких, уже сравнимых между собой моноспоровых клонов на различные питательные среды снова проявлялась их внутренняя дифференциация, которая выражалась в изменении цвета колонии, пигментации субстрата и скорости роста мицелия.

Влияние температуры на развитие гриба. Для установления оптимальных условий развития гриба изучалось влияние различных температур на рост мицелия, пигментацию и образование конидий.

Все штаммы лучше росли при температуре 22°С. Однако здесь наблюдаются различные скорости роста мицелия и в образовании конидий. Штаммы волжский, украинский, дальневосточный и сахалинский намного опережают в росте другие. Особенно отчетливо различия штаммов выявились при анализе развития их в условиях крайних температур (12 и 32СС).

При 32°С штаммы из азиатской части СССР (дальневосточный и сахалинский) не растут, а штаммы из европейской части СССР обнаруживают слабый рост. Наоборот, при 12°С дальневосточный и сахалинский штаммы хорошо развиваются, намного опережая в росте европейские штаммы.

При наиболее благоприятной температуре (22°С) визуально заметный вегетативный рост начинается на третий день, а спороношение — на пятый. При температурах 12 и 32°С наблюдается заметное ограничение роста и спороношения гриба.

То обстоятельство, что все штаммы отличаются между собой по отношению к температуре, скорости роста и образованию спор, позволяет установить явление физиологической дифференциации вида на систему экологических или географических рас.

Изучая моноспоровые штаммы наших популяций, мы также пришли к выводу об их неоднородности. Здесь мы также сталкиваемся с разнообразием в потомстве одной клетки.

При высеве на полные и минимальные среды выявлена значительная внутривидовая и внутрипопуляционная изменчивость V. inaequalis по скорости роста. Это указывало на существование у данного гриба в природных условиях частичных биохимических (ауксотрофных) мутантов, так как обычно ауксотрофные мутанты получаются индуцированным путем. На первом этапе были выделены ауксотрофные штаммы, рост которых можно ускорить добавлением дрожжевого автолизата. Далее потребность штамма в определенных питательных веществах уточняли ауксонографическим методом Бейеринка в модификации Понтекорво (1949). Дальневосточный штамм МКДВ-50 реагировал на внесение смеси аминокислот «Б», МКДВ-10 — на аминокислоты группы «А», МКДВ-44 реагировал на смесь витаминов. Затем описанным методом моноспоровый штамм МКДВ-44 был идентифицирован как нуждающийся в витамине B₁ (тиамине). Многократные пересевы подтвердили наследственный характер признака тиаминнедостаточности штамма МКДВ-44.

Полученные результаты подтверждают наличие внутривидовой изменчивости у гриба V. inaequalis и указывают на существование ауксотрофных мутантов в природе.

На основании экспериментальных данных Клейном (D. M. Kline и др., 1964) был сделан вывод о существовании корреляции между ауксотрофностью и потерей патогенности.

Размер спор у различных географических образцов. Изучение изменчивости можно продолжить и путем изучения наиболее просто учитываемого признака — размера спор.

Этот признак можно рассматривать как один из критериев вида или внутривидовых популяций.

Поскольку размер клетки — возрастной признак, к тому же варьирующий в зависимости от условий развития, то его нельзя выразить одним числом. Обычно указываются крайние из встреченных значений — пределы варьирования. Из статистики следует, что пределы являются непостоянным показателем, ибо крайние значения признака реже встречаются, больше шансов их пропустить и не зафиксировать.

Варьирование количественного признака — это отражение нормы реакции данного организма на условия среды. Количественно норма реакции может быть выражена в первом приближении пределами варьирования, а более точно — наиболее часто встречающейся величиной — модой и сигмой как мерой изменчивости. При обычном характере (Варьирования мода совпадает со средней арифметической из большого числа наблюдений.

Для характеристики размеров спор были произведены промеры длины и ширины аскоспор волжской, азербайджанской, северо-западной и сахалинской популяций, собранных весной 1965 г. и присланных нам соответствующими организациями, произведено измерение высоты и ширины перитециев из этих же географических мест. Измерены по длине и ширине конидии с листьев и конидии географических популяций, выращенных в чистой культуре на среде Чапека. Штаммы в момент измерений имели одинаковый возраст, поэтому они могли быть сравнимы между собой.

Изучая размеры аскоспор различных географических популяций, интересно отметить, что нижние крайние значения длины и ширины у всех популяций одинаковы, а именно, соответственно равны 12 и 6 мкм, причем крайние величины ширины аскоспор у трех популяций находятся в пределах б—7,5 мкм и лишь у одной немного выходят за эти рамки (Волжская — 6—9 мкм).

Наблюдая размеры аскоспор каждой популяции и размеры конидий с листьев и из чистой культуры, убеждаемся, что вариационная изменчивость ряда (а) у аскоспор очень невелика. Это и понятно, так как аскоспоры образуются путем редукционного деления и каждая клетка получает одинаковый гаплоидный набор хромосом.

При сравнительной оценке размеров аскоспоры — органа, наименее вариабельного, четырех географических популяций (северо-западной, волжской, азербайджанской и сахалинской) обнаружены достоверные различия в длине аскоспор этих популяций. При этом длина аскоспор у северо-западной, волжской и азербайджанской популяций сходна, но резко отличается от длины аскоспор сахалинской популяции (достоверность разности в среднем составляет 4,9, в то время как для первой степени вероятности безошибочного суждения для таких наук, как биология, медицина и т. п., достаточно значение td≥1,96), т. е. европейские популяции достоверно отличаются от сахалинской (азиатской). В свою очередь европейские популяции также представляют собой не однородное целое, а состоят из множества форм, имеющих различные морфологические и физиологические особенности.

Этот факт хорошо иллюстрируется на примере измерений конидий в чистой культуре (табл. 6). Все популяции достоверно различаются или по обоим признакам — длине и ширине, или по какому-либо одному из признаков, за исключением дальневосточной популяции, у которой размеры конидий одинаковы с северо-западной.

Таблица 6. Размеры конидий из чистой культуры различных географических популяций и моноспорных штаммов

Этот случай лишний раз доказывает, что при изучении внутривидовой или межвидовой изменчивости недостаточно опираться лишь на различия в величине спор изучаемых объектов.

Далее нам интересно было проследить за изменчивостью организма внутри популяции. С этой целью выделенные моноспоровые изоляты также подвергались статистическому анализу. Были взяты биохимические штаммы МКВ-50 (азербайджанский), МКДВ-10 и МКДВ-44 (дальневосточные), которые достоверно отличаются по какому-либо признаку от своих популяций. Здесь также была подмечена закономерность: чем более однороден изучаемый штамм, тем меньше значение сигмы (а), т.е. сигма является достоверным показателем изменчивости ряда. Так, если у азербайджанской популяции а равна 7,8, то у МКБ-50 — 1,3; у дальневосточной популяции — 2,6, у МКДВ-44—1,1.

Таким образом, вид V. inaequalis (Cke) Wint. имеет внутреннюю дифференциацию, что показывает тенденцию вида к дальнейшему развитию и говорит о его жизнеспособности.

Физиологическая специализация гриба. У возбудителя парши яблони имеется ряд физиологических рас, и отдельные сорта яблонь сильно отличаются по своей восприимчивости к различным расам. Развитие эпифитотий зависит от наличия рас, к которым основные сорта яблонь проявляют восприимчивость.

Большой шаг к выяснению взаимодействий хозяина и паразита был сделан генетикой. Ускорилась селекция сортов сельскохозяйственных культур на устойчивость к болезням, и во многих случаях была выявлена генетическая основа устойчивости. Экспериментально было доказано, что виды растений-хозяев обычно содержат огромное количество биотипов и фенотипов и развитие отдельной особи происходит в результате взаимодействий наследственности и условий окружающей среды. Было установлено, что изменения, ранее относимые к влиянию условий окружающей среды, являются генетически контролируемыми.

Кейт, Бун и Шей (1962) в своих исследованиях роли генетических факторов и питания в регулировании взаимодействий хозяина и паразита при парше яблони показали, что парша яблони является удобным объектом для параллельных генетических и биохимических исследований взаимодействия хозяина и паразита. При болезнях, подобных парше яблони, как хозяин, так и паразит могут размножаться половым или бесполым путем, а взаимодействия хозяина и паразита могут изучаться под точным генетическим контролем условий окружающей среды. У возбудителя парши яблони имеется много генотипов с различными уровнями патогенности для разных видов и сортов хозяина. Его можно культивировать на всем протяжении его жизненного цикла и скрещивать in vitro. Изоляты можно размножать бесполым путем с достаточной стабильностью изучаемых признаков, включая патогенность, в течение многих лет. На всем протяжении паразитической фазы и вегетативной стадии in vitro возбудитель находится в гаплоидном состоянии, поэтому можно исследовать эффекты одного набора хромосом.

Сумка содержит все потомство, происходящее от единственного мейоза, с выживанием всех ядер, расположенных в определенном порядке, что позволяет проследить родословную ядерных поколений. Вегетативные клетки одноядерны и могут изучаться независимо от важных проблем гетерокариоза.

Гриб хорошо реагирует на мутагенные воздействия. Кейтом и Буном были получены мутации формы, окраски и биохимического состава. Среди большого количества биохимических мутантов V. inaequalis каждый из 54 изученных признаков наследовался так, как если бы они контролировались одним геном, и почти все случаи дефектов синтеза были полными. Генетическим анализом установлены группы сцепления для шести хромосом. Было найдено, что гаплоидное число хромосом у гриба равно семи.

Кейт и Палмитер (G. W. Keitt, О. Н. Palmiter, 1938) изучали гетероталлизм и изменчивость у V. inaequalis. Полученные восемь моноспоровых штаммов из одной сумки культивировались на листьях яблони. Исследования показали, что не каждые два из этих восьми штаммов могут скрещиваться и давать плодовые тела. Эти восемь штаммов по своим половым особенностям делятся на две группы, и только при скрещивании двух соответствующих штаммов из разных групп можно получить перитеции. Штаммы характеризуются также патогенными особенностями.

По-видимому, устойчивость хозяина зависит от целого ряда генных фондов. На основании реакции специализированных рас гриба (J. R. Shay, E. В. Williams, 1956) хозяев можно разделить на четыре основные группы.

1. Промышленные сорта яблонь, которые полностью восприимчивы в полевых условиях к некоторым линиям патогенных микроорганизмов.

2. Канадский сорт Женева неизвестного происхождения и русские сорта видов Malus baccata и Malus pumila, которые обычно иммунны в полевых условиях, но восприимчивы к определенным расам патогенных организмов.

3. Виды Malus, в основном происходящие из Азии, которые иммунны в полевых условиях и устойчивы ко всем линиям патогенных организмов, насколько это исследовано.

4. Русские и европейские сорта, такие, как Антоновка, которые обладают высокой устойчивостью ко веем исследованным линиям патогенных организмов.

В настоящее время изучается биохимическое регулирование нормальных реакций между линиями дикого типа V. inaequalis и четырьмя группами хозяев.

Кейтт, Бун и Шей (1962) изучали наследование патогенности моноспоровых линий дикого типа V. inaequalis на сортах-хозяевах с фондом генов обычной яблони (Malus sylvestris Mill.).

Опыты показали только два основных типа реакции хозяина к проникновению паразита — «поражение» и «пятно». Реакция «поражение» (восприимчивость хозяина) дает обычные в естественных условиях симптомы, характеризующиеся обильным спорообразованием гриба; реакция «пятно» (устойчивость хозяина) дает хлоротические или некротические пятна с незначительным спорообразованием или без него.

Кейт и Бун (1951, 1957) показали, что патогенность контролируют семь пар локусов. Каждый локус представлен двумя аллелями, одна из которых обусловливает на определенных сортах реакцию типа «поражение», а другая — «пятно».

Приведенные данные свидетельствуют о том, что многообразие и динамичность состава биотипов гриба оказывают глубокое влияние на изменение поражаемости различных сортов, а также и одного сорта в различные годы и в различных эколого-географических условиях.

М. А. Чумаевская (1960) изучала некоторые географические популяции парши яблони и пришла к выводу, подтвердившему высказывания других исследователей, что в условиях Сибири и Алтая имеется особая форма гриба. Сибирские и алтайские популяции гриба способны поражать местные, полукультурные мелкоплодные сорта яблонь — ранетки. Крупноплодные сорта в Сибири парша не поражает или поражает очень слабо.

В Южном Казахстане также имеются, по данным Л. П. Сахаровой (1968, 1971), две резко обособленные расы возбудителя парши, специализированные в отношении дикой и культурной форм яблони. Причем появление парши на культурных сортах яблони отмечается впервые с 1960 г., и связано это явление с интродукцией яблони.

Физиологическая специализация гриба в отношении питающего растения в условиях Ленинградской области изучалась в течение 1946—1948 гг. В. И. Шалышкиной. Исследования показали, что северо-западная популяция гриба широко дифференцирована на многочисленные группы, отличающиеся между собой по морфологическим и культуральным признакам (размерам и обилию конидий, окраске, форме и структуре колоний на искусственных питательных средах).

Физиологическая специализация проявилась в том, что были обнаружены штаммы гриба, изменяющие свои признаки агрессивности в зависимости от сорта.

В отношении штаммов гриба испытывавшиеся сорта разделились на сорта-аккумуляторы и сорта-депрессаторы инфекции. Для первых характерно сильное поражение почти всеми штаммами, для других — слабое поражение. Имеются также сорта пластичные, способные поражаться одними штаммами и не поражаться другими.

Приведенные материалы свидетельствуют о резко выраженной изменчивости гриба V. inaequalis. Эти особенности показывают также, что формообразовательные процессы у возбудителя парши яблони еще более усиливаются в результате сумчатого спороношения и происходящих при этом процессов расщепления признаков и образования новых биотипов в потомстве. Все эти процессы определяют многообразие и динамичность состава биотипов V. inaequalis.

В заключение приводим описание внутривидовых подразделений Venturia inaequalis в пределах СССР.

I группа форм (европейские формы). Размеры аскоспор 14 — 14,3×6,7—7 мкм. Штаммы, относящиеся к этой группе, характеризуются сходными требованиями к температурным условиям. В условиях крайних температур (12 и 32°С) обнаруживают слабый рост мицелия. Оптимальной является температура 22°С.

Северо-западная форма. Отмечена в Ленинградской области. Перитеции имеют средние размеры 234,3×258,4 мкм, аскоспоры — 14,1×6,9 мкм. Размеры конидий с листьев 19,6×6,9 мкм. Конидии из чистой культуры имеют средние размеры 20,2×7,7 мкм. Рост мицелия при температуре 12°С очень слабый, при 32°С почти отсутствует. На добавление к питательной среде дрожжевого автолизата реагирует средне. В культуре гриба преобладает 2-й тип мицелия. На питательных средах спороношение среднее.

Волжская форма. Отмечена в Саратовской области. Размеры перитециев 160,6×160,5 мкм, аскоспор — 14,3×7 мкм, конидий с листа — 19,2×7,4 мкм. Размеры конидий из чистой культуры не представлены, так как штамм очень слабо спороносит на питательных средах. Рост мицелия при температуре 12°С слабый, при температуре 32°С очень слабый. На добавление к питательной среде дрожжевого автолизата реагирует в большой» степени. В культуре гриба преобладает 1-й тип мицелия.

Украинская форма. Отмечена в Полтавской области. Размеры конидий с листьев 18,6×8,6 мкм, из чистой культуры — 29,1×8,5 мкм. Рост мицелия при температуре 12°С слабый, при температуре 32°С сильнее, чем у Волжской формы. На добавление К питательной среде автолизита реагирует слабо. В культуре гриба преобладают 1-й и 2-й типы мицелия. Спороношение обильное.

Азербайджанская форма. Отмечена в Баку. Размеры перитециев 214,1×207,4 мкм, аскоспор — 14×6,7 мкм, конидий из чистой культуры — 28,3×9,4 мкм. Отмечен хороший рост мицелия при крайних температурах 12 и 32°С. На добавление к питательной среде дрожжевого автолизата реагирует сильно.

Выявлены ауксотрофные штаммы (МКБ-50) с потребностью в аминокислотах группы «Б». В культуре гриба преобладает 3-й тип мицелия. Спороношение среднее.

II группа форм (азиатские формы). Размеры аскоспор 15×6,7 мкм. Штаммы, относящиеся к этой группе, характеризуются близкими температурными кривыми. В условиях крайних температур (12 и 32°С), в частности при 12°С, обнаруживают сильный рост мицелия, но при 32°С рост мицелия отсутствует. Оптимальной является температура 22°С.

Дальневосточная форма. Отмечена в Хабаровском крае. Размеры конидий из чистой культуры 21,2×7,4 мкм. В культуре гриба преобладает 1-й тип мицелия. Спороношение слабое. На добавление к питательной среде дрожжевого автолизата реагирует в большой степени. Выявлены ауксотрофные штаммы МКДВ-10 с потребностью в аминокислотах группы «А» и МКДВ-44 с потребностью в витаминах, в частности в тиамине.

Сахалинская форма. Отмечена на о. Сахалине. Размеры перитециев 162,6×182,8 мкм, аскоспор — 15×6,7 мкм, конидий из чистой культуры — 28,9×7,3 мкм. В культуре гриба преобладают 1-й и 4-й типы мицелия. Спороношение слабое. На добавление к питательной среде дрожжевого автолизата реагирует в средней степени.

Таким образом, в результате проведенных исследований можно сделать следующие выводы.

1. На основании сравнительного изучения штаммов V. inaequalis (Cke) Wint., полученных из различных географических районов Советского Союза, установлено, что в пределах нашей страны этот гриб является неоднородным как в отношении морфологии, так и в отношении биологических особенностей.

2. На территории Советского Союза нами выявлены две группы штаммов гриба, которые названы европейской группой и азиатской группой, и шесть форм гриба, являющихся, вероятно, местными географическими расами. Каждой из них дана характеристика.

3. Установленные морфологические и биологические особенности рас являются наследственно постоянными.